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最新研究报道

NAD调控线粒体自噬参与阿尔茨海默病的保护机制

总结:NAD+及其前体物质可通过SIRT1及SIRT3等多条通路调控线粒体自噬,清除损伤线粒体、Aβ和tau蛋白等与AD的相关病理改变,改善认知功能障碍。因此,NAD+前体治疗有望成为AD预防和治疗的新策略。 


阿尔茨海默病(AD)是一种以进行性记忆减退和认知功能障碍为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病,主要的病理学表现为细胞外β淀粉样蛋白(Aβ)沉积以及细胞内过度磷酸化tau蛋白的神经纤维缠结形成。已有研究证明线粒体功能缺陷与AD等神经退行性病变密切相关。Swerdlow等(2004)提出“线粒体级联假说”,认为线粒体功能缺陷及氧化应激的增加发生于AD早期,为Aβ及神经纤维缠结形成的上游事件,是影响晚发AD病理学的主要因素。近期研究表明,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)可通过维持线粒体生物发生和线粒体自噬之间的平衡影响神经元的健康和存活,在AD发生发展过程中发挥重要作用。

 

1、线粒体自噬和NAD+的基本概念

线粒体自噬:线粒体在能量代谢、抗活性氧化及贮存Ca2+等方面发挥重要作用,但病理情况下,线粒体损伤会发生能量代谢障碍,并形成过多的氧自由基(ROS),加快线粒体DNA损伤。损伤的mtDNA累积反之促进能量代谢障碍及产生ROS,导致神经元功能紊乱、甚至死亡,形成一个恶性循环。因此,维持线粒体正常功能对神经元健康至关重要。自噬可通过降解细胞质中的长寿蛋白和细胞器、清除损伤的胞质内容物等维持细胞稳态,在保持细胞的健康过程中起重要作用。其中,线粒体自噬是细胞清除异常线粒体并维持其正常功能的重要调节机制,构成了线粒体的“质量检查站”。线粒体自噬主要包括两个阶段:第一阶段,泛素化的线粒体协同自噬相关蛋白在自噬体结合位点上结合(图1);第二阶段,隔离膜形成将损伤的线粒体包裹并与溶酶体融合从而降解线粒体。线粒体功能失调是AD等多种神经退行性疾病的标志物,研究发现,促成因素可能与NAD+耗尽有关。 

NAD+:NAD+不仅可以作为y氧化还原方面酶的辅酶,也是sirtuin家族中去乙酰酶、DNA修复蛋白多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)及环状ADP核糖水解酶CD38和CD157等多种酶的关键辅酶,参与线粒体自噬、细胞DNA损伤修复和钙稳态等多种生理活动。

Sirtuin家族是一种从细菌到人类高度保守的去乙酰化酶类,人类sirtuin家族中公认的成员有7个:沉默信息调节因子(SIRT)1~7。哺乳动物sirtuin可与p53、FOXO/PGC-1α、NF-κB、Ku70等蛋白相互作用调控着细胞应激反应、代谢、衰老和凋亡等过程。其中,SIRT1是一种调节多种细胞通路并阻止老化和年龄相关疾病发展的脱乙酰酶,而过氧化物酶体增殖物激活受体1(PARP1)感知DNA损伤并消耗NAD+合成PARP以募集DNA修复蛋白。这两个重要的过程都需要NAD+作为辅酶才能正常活动,如果NAD+的生物利用度降低,那么SIRT1和PARP1将会竞争有限的NAD+,从而限制细胞内彼此的活性。神经元具有相对较高的能量需求,对NAD+消耗和ATP产生受损非常敏感。多项研究表明神经元生物能量受损和DNA修复缺陷在AD起始和进展中发挥重要作用,而补充NAD+前体如烟酰胺核糖核苷和烟酰胺可改善神经退行性疾病的某些年龄相关病理学表型,并减轻由DNA修复酶突变引起的早衰小鼠模型的病理表型.此外,在秀丽隐杆线虫和小鼠中都观察到补充NAD+后寿命延长及健康改善.然而,NAD+在AD中的作用及通过何种途径发挥作用仍不清楚。

 

2、NAD+调控线粒体自噬
SIRTs是一组NAD+依赖性的脱乙酰酶和ADP-核糖基转移酶,具有促进线粒体内环境平衡、神经元存活、干细胞再生以及预防衰老等多种功能。细胞核SIRT1和线粒体SIRT3与延长寿命和神经保护有关,这些蛋白减少可能导致包括AD在内的多种神经退行性疾病。研究表明,AD患者顶叶皮质中SIRT1蛋白表达显著降低且与Aβ和tau蛋白聚集密切相关。APP/PS1双转基因AD小鼠神经元中也发现SIRT3水平降低。而NAD+可通过SIRT1-PGC1α通路和SIRT3-FOXO3通路控制线粒体生物发生和线粒体自噬之间的平衡,从而影响神经元的健康和存活。 

2.1NAD+-SIRT1通路研究

发现SIRT1是诱导自噬所必需,SIRT1过表达可增加自噬,使用SIRT1激活剂白藜芦醇也能诱导自噬。研究显示,SIRT1上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PARPγ)辅助激活因子-1α(PGC-1α),通过脱乙酰化和激活自噬相关蛋白ATG5、ATG7、ATG8等稳定PINK1,上调线粒体自噬受体BNIP3L/NIX和LC3,在自噬/线粒体自噬诱导中发挥重要作用,SIRT1缺乏则自噬被抑制。NAD+-SIRT1通路激活能上调各种自噬相关蛋白从而修复线粒体自噬。ATM蛋白激酶是一种相对分子质量为350000.

丝氨酸/苏氨酸激酶在DNA修复和多种细胞稳态途径中发挥作用。在跨物种研究中,无论是原代大鼠神经元,秀丽隐杆线虫还是共济失调毛细血管扩张症小鼠,结果均显示毛细血管扩张性共济失调突变基因(ATM)损失诱导线粒体功能障碍及PARP1的持续激活,进而消耗NAD+,使SIRT1失活而导致线粒体自噬功能障碍。补充NAD+后,ATM蛋白激酶缺陷神经元的DNA修复缺陷和线粒体功能障碍得到显著改善ATM-/-模型小鼠的健康改善,寿命也得以延长。蠕虫的细胞周期相关蛋白1与哺乳类动物BNIP3/NIX为直系同源物,作为线粒体外膜蛋白,近期已被证明是线粒体自噬的主要参与者,研究发现激活NAD+-SIRT1途径可以上调DCT-1和激活自噬相关蛋白恢复线粒体自噬。此外,NAD+-SIRT1通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)促进ATG1的ULK1磷酸化诱导自噬和(或)线粒体自噬。同样,NAD+-SIRT1可以激活原代大鼠皮质神经元中的AMPK使结节性硬化复合物2Ser1387位点磷酸化,抑制哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)从而诱导自噬和(或)线粒体自噬。 

2.2NAD+-SIRT3通路SIRT3定位于线粒体

是一种NAD+依赖性蛋白脱乙酰酶,可调节线粒体功能和代谢以应对能量缺陷和应激。叉头转录因子家族中的FOXO3是SIRT3的直接靶点,参与调节细胞发育、分化、存活、凋亡和自噬等多种细胞活动过程。线粒体结构和功能的完整性可通过调控线粒体发生和线粒体融合/裂变辅助的线粒体自噬之间的平衡来维持。研究发现,过氧化氢诱导SIRT3在K271和K290处使FOXO3脱乙酰化,从而驱动多个与线粒体稳态密切相关的基因表达。研究结果表明SIRT3-FOXO3不仅通过上调PGC-1α和TFAM促进线粒体生物合成,还诱导Drp1、Fis1和Mfn2协调线粒体的分裂/融合,并可增加自噬相关蛋白BNIP3、NIX和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值促进线粒体自噬。此外,SIRT3-FOXO3诱导自噬蛋白P62聚集在泛素化的线粒体底物上并形成自噬溶酶体对底物进行降解。心脏缺血再灌注损伤模型中,SIRT3-FOXO3通过诱导PINK1促进PARKIN的活化,激活线粒体分裂和线粒体自噬,在缺血再灌注中发挥保护作用。近年的研究表明,链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中线粒体自噬被抑制,敲除SIRT3则进一步加剧。相反,体外实验中SIRT3过表达线粒体自噬激活,使用自噬抑制剂3-MA则SIRT3诱导的自噬激活减弱。呼吸链复合体I是线粒体中NADH的主要氢化物受体,若活性降低则NADH增加而NAD+相对减少。研究发现,NAD+下降导致SIRT3活性下降,显著的线粒体蛋白乙酰化,加速心力衰竭。补充NAD+前体烟酰胺单核苷酸(NMN)后,大多数现象得到改善。基于人类胶质瘤细胞的研究也表明,SIRT3基因敲除以减弱缺氧诱导的LC3在线粒体上的定位和线粒体自噬。


3.NAD+调控线粒体自噬参与AD的保护机制.
近几十年来,针对AD发病机制的研究主要集中于Aβ和tau蛋白假说。但近年研究发现,线粒体功能障碍可能发生于Aβ和tau蛋白聚集前,在AD发病早期的发生发展过程中发挥重要作用。AD动物和细胞模型以及散发性迟发型AD患者的研究结果表明(图4),线粒体自噬受损通过增加氧化损伤和细胞能量缺陷触发Aβ和tau蛋白积聚,从而导致突触功能障碍和认知缺陷,反之又促进线粒体自噬损害。补充NAD+有利于线粒体功能恢复,延缓AD进程。有学者在24例年龄在55~79岁的健康者中进行了服用烟酰胺核糖核苷研究,其中12例参与者先服用安慰剂×6周,接着每天2次口服烟酰胺核糖核苷500mg;另12例参与者先每天2次口服烟酰胺核糖核苷500mg×6周,接着服用安慰剂;结果显示两组受试者服用烟酰胺核糖核苷1000mg·d-1期间受试者NAD+水平相较于基线水平均提高了60%。而先前的研究已经证实NAD+是激活与线粒体自噬相关的sirtuins所必需的。由此,该研究启动了一项单独的试验,调查烟酰胺核糖核苷对患有轻度认知功能障碍老年人的影响,并推测:上调患者NAD+水平,可以激活sirtuins及其下游的线粒体自噬相关蛋白,该通路参与了延缓AD病程的保护机制。 

3.1NAD+调控线粒体自噬对Aβ的作用
据报道,Aβ通过线粒体外膜转运体(TOM)进入线粒体,抑制线粒体前体蛋白酶的活性,使蛋白质水解系统受损,产生ROS,进而使呼吸链受损,细胞能量供应不足,并可能导致损伤的线粒体不能通过自噬溶酶体系统进行线粒体自噬予以清除。与此一致的是,AD小鼠模型中过表达Parkin,可以促进缺陷线粒体的自噬清除,减轻线粒体功能障碍。辅助激活因子-1α作为SIRT1的下游分子参与调控β分泌酶(BACE1)降解,是影响Aβ产生的关键调节因子。研究发现Tg2576AD小鼠模型使用烟酰胺核糖核苷处理3个月可增强PGC-1α在脑中的表达,促进BACE1的降解和减少Aβ产生。Tg2576胚胎原代神经元培养中,经烟酰胺核糖核苷处理后,BACE1蛋白质含量降低,PGC-1α过表达则进一步增强BACE1泛素化和蛋白酶体降解。研究结果提示NAD+可能通过SIRT1-PGC-1α通路调控线粒体自噬减少脑内Aβ的产生,改善AD突触可塑性和认知功能。

3.2NAD+调控线粒体自噬对tau蛋白的影响

有研究报道,人类野生型全长tau在细胞内的聚集,能通过直接插入到线粒体膜上,提高线粒体膜电位,造成PINK1/Parkin途径的损伤,从而诱导线粒体自噬障碍。研究表明在DNA修复缺陷的新AD小鼠模型中,NAD+水平降低,SIRT3活性下降,补充NAD+前体烟酰胺核糖核苷后SIRT3活性增强,神经炎症、突触传递、tau蛋白磷酸化、DNA损伤以及学习记忆功能得到显着改善,提示NAD+-SIRT3通路介导的线粒体功能受损在由DNA损伤增加引起的神经病理性改变中发挥重要作用。类似的研究用烟酰胺处理3xTgAD小鼠8个月后,可保持线粒体完整性且增强溶酶体/自体溶酶体降解以减少自噬体积聚,导致海马和大脑皮质中的Aβ和超磷酸化tau蛋白减少,从而使认知功能改善。由于NAD+-SIRT1可通过对主要自噬蛋白Atg5、Atg7和Atg8的脱乙酰化上调自噬,而自噬和(或)线粒体自噬的上调可清除Aβ斑块和过度磷酸化tau蛋白的神经纤维缠结,改善线粒体功能和神经元存活。因此,补充NAD+及其前体物质可对AD等年龄相关性疾病发挥保护性作用。一项Meta分析结果显示,轻度认知功能障碍在中国的发病率较高,达到了12.7%。若轻度认知功能障碍患者没有得到及时有效的干预,会有较高的风险发展成为AD。从轻度认知功能障碍进展到AD,自噬等线粒体功能障碍是促进Aβ和tau蛋白聚集的触发因素。而NAD+及其前体物质可通过SIRT1及SIRT3等多条通路调控线粒体自噬,清除损伤线粒体、Aβ和tau蛋白等与AD的相关病理改变,改善认知功能障碍。因此,NAD+前体治疗有望成为AD预防和治疗的新策略。

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